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Vaso de bohemia
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Varilla de vidrio
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Mechero
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Tela metálica
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Tubos de ensayo
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Termómetro
Reactivos utilizados:
- Hidróxido de sodio al 10% (NaOH)(Biuret)
- Sulfato cúprico al 1% (CuSO4 )(Biuret)
- Ácido nítrico concentrado
- (HNO3 )(xantoproteica)
- Ácido etanoico 2,0M
- Agua
- Leche descremada en polvo
- Clara de huevo
- Gelatina
- Glicina
- Aspartamo
Fundamento de los ensayos de
caracterización:
Los ensayos de
Biuret y Xantoproteico permiten determinar el carácter proteico de las
sustancias a estudiar. Sin embargo, las vías para ello utilizadas por cada uno
difieren.
Biuret
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la
presencia de proteínas, péptidos cortos y otros
compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida
El biuret es un grupo químico con fórmula R2NC(O)NHC(O)NHR2.
La reacción debe su nombre
al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (un dímero de urea),
por ejemplo (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla con la cual esta
reacción da positiva.
Mediante la reacción del Biuret podemos determinar la
presencia de proteínas en una muestra.
El reactivo de Biuret contiene sulfato cúprico (CuSO4)
en solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH).
Para nuestra actividad experimental utilizamos NaOH al 10 %, y lo
suministramos mediante un cuenta gotas. El ensayo de Biuret lo haremos
añadiendo a la muestra que se encuentra en los tubos de ensayo veinte gotas de
hidróxido de sodio (NaOH) al 10% y dos gotas de sulfato cúprico (CuSO4) al 1%.
La reacción se
basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de
un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.
La formación del biuret la producen los
péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la
presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los
aminoácidos.
Cuando una proteína se
pone en contacto con una base concentrada, se forma la sustancia compleja
denominada Biuret
Al agregar el reactivo de sulfato de cobre
(CuSO4) más la solución de proteína precipita, y puede ocurrir que:
POSITIVO:
Detectamos un postitivo con el reactivo de
Biuret cuando el mismo se torna a una coloración violeta. Ya que el resultado
de dicha prueba fue positivo concluimos que en dicha muestra encontramos
enlaces peptídicos, característicos de las proteínas. Con esta reacción se
obtiene un resultado positivo en todos
los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus
moléculas. No identifica si una muestra
tiene solo aminoácidos porque para que se dé la reacción debe haber dos o más
uniones peptídicas. Al esta ser una reacción
cuantitativa la intensidad del color violeta indica una mayor presencia de
enlaces peptídicos en la muestra.
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Ejemplo de positivo |
Nota: También
puede ocurrir que se torne en una coloración rosa cuando se combina con poli péptidos de cadena corta
NEGATIVO:
Si la coloración final no es violácea, el resultado
es negativo lo que significa que no hay por lo menos dos enlaces peptídicos en
la muestra.
Al no ser un reactivo que reaccione solamente con proteínas, se debe
tomar extremo cuidado a la hora de obtener los resultados. Los mismos deben ser
evaluados cuidadosamente, para asegurarnos que no sean erróneos
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Ejemplo de negativo(Izq) junto a su testigo(Der) |
Ensayo Xantoprotéica
El ensayo
Xantoproteico detecta la presencia de proteínas solubles, empleando ácido
nítrico. Esta prueba es más específica que el Biuret dado que
caracteriza a los aminoacidos aromáticos. La reacción ocurre cuando se
produce la nitración del anillo aromático presente en los aminoacidos
(tirosina, triptófano, fenilalanina) por la obtención de nitrocompuestos de
color amarillo.En las condiciones del experimento, solo la tirosina y el
triptófano daran positivo, esto es porque su anillo bencenico contiene un OH
que lo hace más suceptible al ataque electrofílico.
Este ensayo
consiste en agregar alrededor de 10 gotas de HNO3 concentrado a una
sustancia.
POSITIVO
Esta
sustancia, al cabo de unos minutos, puede tornarse amarilla(lo que implica que
dio positivo).Da positivo cuando la sustancia que está siendo analizada posee
aminoácidos con grupos aromáticos, principalmente el grupo fenólico de la tirosina.
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Ejemplo de positivo |
NEGATIVO
Si esta
sustancia al cabo de unos minutos no altera su coloración podemos concluir que
el resultado del ensayo xantoproteico es negativo por lo cual no se ha
detectado una sustancia que posea restos aromáticos.
A diferencia
de la reacción de Biuret, el ensayo xantoproteico es cualitativo, no
cuantitativo.
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Ejemplo de negativo |
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